Resident Evil: Zero tiene lugar antes de los eventos del Resident Evil original . Asumes el papel de uno de dos personajes; Rebecca Chambers, la médica del equipo Bravo que se encontró en el primer juego, y Billy Coen, un ex convicto que estaba siendo transportado. El juego comienza con el equipo Bravo volando por encima, en camino a investigar una serie de asesinatos. Algo sucede y el helicóptero se estrella. Todos sobreviven, pero cuando empiezan a buscar, se encuentran con un camión de transporte militar volcado, con nada más que cadáveres dentro. Rebecca Chambers, la miembro más joven del equipo STARS Alpha, va a investigar el tren de lujo de la compañía Umbrella, que misteriosamente se ha detenido en medio del bosque. Ahora tomas el control de Rebecca y comienza tu viaje.
Además de la jugabilidad tradicional de terror de supervivencia de la serie, el juego presenta lo que llama un sistema de "zapping de socios", que te permite cambiar entre Rebecca y Billy en cualquier momento. Esta característica debe usarse en ocasiones, ya que el juego requiere que ambos personajes trabajen juntos para resolver algunos acertijos. Lo nuevo en el juego son un montón de enemigos terroríficos, como el ciempiés mutante, nuevas áreas para explorar y la capacidad de dejar caer objetos al suelo en lugar de tener que buscar una caja de objetos.
A diferencia del lanzamiento original de GameCube, todos los ports mejorados posteriores cuentan con un modo Wesker adicional que se desbloquea después de completar el juego. Ese modo agrega dos trajes nuevos, una apariencia de Rebecca controlada por ojos rojos y una apariencia de Wesker para Billy con ciertas habilidades especiales para Wesker. Ambas máscaras parecen haberse basado en Wesker y Jill de Resident Evil 5 , que se produjo después del lanzamiento de este juego en GameCube.