Los Asesinos de hoy en día, incluido Desmond Miles, escapan y se esconden de los Templarios. Se refugian en la actual Monteriggioni, que se ha conservado como un sitio histórico. Allí, configuraron el Animus para que Desmond explore más profundamente el pasado de Ezio y descubra más sobre las Piezas del Edén que faltan. La historia de Ezio tiene lugar inmediatamente después del final de Assassin's Creed II , y lo hace salir de Roma para regresar a Monteriggioni. Allí, es emboscado y roban el fragmento del Edén que ha encontrado. Debe regresar a Roma, que desde entonces ha sido tomada por los Borgia, rescatar a su gente y recuperar lo que se ha perdido.
Assassin's Creed: Brotherhood continúa la historia de Assassin's Creed II. Los jugadores asumen el papel de Ezio mientras usan sus habilidades de asesino para liberar Roma y luchar contra los Templarios. Los jugadores asumen misiones para progresar en la historia, ganar dinero y liberar gradualmente a la ciudad de la influencia de los Borgia. Específicamente, al quemar las trece torres Borgia que se están utilizando para hacer cumplir su gobierno, Ezio puede recuperar áreas de Roma para la gente y usar su dinero para restaurar tiendas, túneles de atajos e incluso puntos de referencia romanos. Al hacer esto, los jugadores también obtienen ingresos regulares de Roma, que pueden reclamar en cualquiera de los bancos de Roma.
Nuevo en Assassin's CreedLa serie es un componente multijugador. La historia de fondo detrás del modo multijugador es que Abstergo, la organización Templar, está usando dispositivos Animus para entrenar a sus reclutas para que se conviertan en Asesinos. Asumes el papel de un recluta de Abstergo y debes encontrar y asesinar a tu objetivo mientras te siguen para asesinarlo tú mismo. Debes asegurarte de no despertar sospechas, de lo contrario, resultará obvio que eres un asesino en lugar de un ciudadano, lo que facilitará que te detecten y derriben. Mientras juegas, ganas puntos que te permiten subir de nivel y mejorar las habilidades y habilidades de tu personaje.